Viability, stability and antimicrobial susceptibility studies of a “next generation probiotic” : faecalibacterium prausnitzii

Recentemente, a bactéria comensal intestinal Faecalibacterium prausnitzii tem surgido como um forte candidato a probiótico de nova geração, devido ao seu papel promissor no tratamento e prevenção de doenças inflamatórias intestinais. Porém, uma grande barreira no desenvolvimento de produtos alimentares, terapêuticos e nutracêuticos é a sua natureza anaeróbia estrita. Assim, o objetivo principal desta tese foi investigar formulações liofilizadas incorporando prebióticos, antioxidantes e crioprotetores, como uma ferramenta biotecnológica para aumentar a estabilidade e viabilidade de F. prausnitzii durante o armazenamento aeróbio e quando exposto a condições de simulação de trato gastrointestinal. Numa primeira fase, foi executada uma caracterização fenotípica da estirpe F. prausnitzii DSM 17677. A curva de crescimento obtida mostrou que uma segunda subcultura bacteriana, incubada entre 10 a 12 horas, corresponde à fase exponencial da cultura, apresentando valores elevados de células viáveis (8.43 ± 0.04 Log CFU/mL). Pela coloração de Gram e pelas propriedades morfológicas confirmou-se que é um bacilo gram negativo, que forma colónias circulares, convexas e esbranquiçadas. Pela exposição ao oxigénio verificou-se uma elevada inibição do crescimento bacteriano pelo método das placas após 1 minuto de exposição, sendo que pelo método dos tubos contendo suspensão bacteriana a viabilidade foi preservada (7.40 ± 0.13 Log CFU/mL versus controlo inicial de 7.29 ± 0.25 Log CFU/mL). Quando exposta a pH ácido durante 2 horas, uma elevada inibição do crescimento bacteriano foi observada a pH 3, sendo que a pH 5 a viabilidade sofreu pequenas alterações (7.17 ± 0.19 Log CFU/mL) face ao controlo (7.40 ± 0.23 Log CFU/mL). A exposição a sais biliares a diferentes concentrações [0.1 - 0.5 % (m/v)], por 3 horas, revelou uma elevada sensibilidade desta bactéria quando presente nessas condições. Adicionalmente, verificou-se que F. prausnitzii DSM 17677 é resistente à ampicilina, gentamicina, canamicina, estreptomicina e eritromicina, mas suscetível à vancomicina, clindamicina, tetraciclina e cloranfenicol. Após caracterização fenotípica, foram desenvolvidas formulações liofilizadas de forma a aumentar a viabilidade de F. prausnitzii durante o armazenamento aeróbio, resultando numa formulação contendo inulina a 5 % (m/v) com sacarose a 5 % (m/v), cisteína a 0.2 % (m/v) e riboflavina (16.5 mM), que apresentou elevadas taxas de sobrevivência (acima de 65%) e valores aceitáveis de células viáveis (> 4.5 Log CFU/g) durante 4 dias de armazenamento aeróbio à temperatura ambiente. Contudo, ao expor esta formulação a pH ácido e sais biliares verificou-se que não ofereceu proteção adicional face à exposição utilizando apenas bactéria sem formulação.The gut commensal bacterium Faecalibacterium prausnitzii has been recognized as a next generation probiotic candidate due to its promising outcomes in the treatment and prevention of intestinal inflammatory diseases. However, its strict anaerobic nature is a hurdle in the development of foods, nutraceutical or therapeutic products incorporating this novel bacterium. Therefore, the main objective of this thesis was to explore freeze-dried formulations containing prebiotic, cryoprotectant and antioxidant agents as a biotechnological strategy to enhance F. prausnitzii viability and stability under aerobic storage and when subjected to harsh gastrointestinal tract conditions. Firstly, a comprehensive phenotypic characterization involving the F. prausnitzii DSM 17677 strain was performed. The growth kinetics revealed that a second bacterial subculture with 10- 12 hours of incubation time corresponds to a bacterial culture in the exponential phase with high viable cells numbers (8.43 ± 0.04 Log CFU/mL). The gram staining and morphological traits confirmed this strain is a gram-negative rod, forming milky white, convex and circular colonies. Exposure to ambient air revealed a high inhibition ( 4.5 Log CFU/g) during 4 days of aerobic storage at room temperature. However, when this formulation was exposed to bile and acidic pHs, no further protection was granted in comparison to non-formulated bacteria